Pore-C 教程：基于 hifiasm 单倍型组装结果的单倍型感知挂载（以四倍体为例）¶

本教程介绍如何使用 Hifiasm（结合 Pore-C 转换的 Pseudo-Hi-C 数据） 构建四倍体基因组的预分离单倍型（pre-separated haplotypes），然后使用 C-Phasing 的单倍型感知模式（--mode hapaware）对其进行染色体水平的挂载（Scaffolding）。

该工作流的目标是在保持单倍型一致性的同时，产生染色体水平的挂载结果。

1. 单倍型解析的 Contig 组装（Pore-C 转 Pseudo-Hi-C）¶

在挂载之前，我们通过将 Pore-C 数据转换为虚拟的、双端（paired-end）的“pseudo-Hi-C”数据来引导 Hifiasm 的分型算法，从而生成单倍型解析的 contigs。

步骤 1.1：生成初始 Unitigs¶

首先，在默认模式下使用 PacBio HiFi 测序数据运行 hifiasm 以生成初级 unitigs，并将 GFA 图结构转换为 FASTA 格式：

~/software/hifiasm-0.25.0/hifiasm -t 100 \
    -o hifi.asm \
    hifi.fastq.gz

gfatools gfa2fa hifi.asm.p_utg.gfa > hifi.asm.p_utg.fasta

步骤 1.2：将 Pore-C 数据比对回 Unitigs¶

将 Pore-C 数据比对回生成的 unitigs 以捕获多维相互作用（multi-way contact）信息：

cphasing mapper hifi.asm.p_utg.fasta porec_reads.fastq.gz -t 100 -o porec_reads.porec.gz

步骤 1.3：将 Pore-C 转换为 Pseudo-Hi-C 数据¶

将多维相互作用的 Pore-C 比对结果转换为虚拟的、标准双端 "pseudo-Hi-C" 数据（即 porec2hic_R1.fa.gz 和 porec2hic_R2.fa.gz）：

cphasing-rs porec2reads porec_reads.porec.gz -l 0 -o porec2hic

步骤 1.4：使用 Hifiasm 进行组装解析（Hi-C 模式）¶

使用 PacBio HiFi 数据以及新生成的 pseudo-Hi-C 双端数据运行 hifiasm 的 Hi-C 模式，以获得分型后的 contig 数据集：

~/software/hifiasm-0.25.0/hifiasm -t 100 \
    -o hifi.asm \
    hifi.fastq.gz \
    --h1 porec2hic_R1.fa.gz \
    --h2 porec2hic_R2.fa.gz 

这将会产生不同单倍型的组装结果（例如，hifi.asm.hic.hap1.p_ctg.fasta 到 hifi.asm.hic.hap4.p_ctg.fasta）。

2. 准备合并的 FASTA 文件¶

C-Phasing 需要输入单个组装 FASTA 文件作为待挂载的 contig 集合。
对于单倍型感知挂载，需要将刚才输出的各个单倍型组装结果合并为一个单独的 FASTA 文件：

cat hifi.asm.hic.hap1.p_ctg.fasta \
    hifi.asm.hic.hap2.p_ctg.fasta \
    hifi.asm.hic.hap3.p_ctg.fasta \
    hifi.asm.hic.hap4.p_ctg.fasta > haps.concat.fa

重要提示：确保 Contig 名称唯一¶

请确保不同单倍型之间的 Contig ID 是唯一的。如果 hifiasm 默认已经为每个单倍型的 contig 添加了前缀（默认即是如此），则直接合并即可。否则，请重命名 contigs 以避免命名冲突。

3. 提供初始单倍型聚类文件（-fc）¶

--mode hapaware 专为已预先分离的单倍型设计。
提供初始聚类文件有助于 C-Phasing 在挂载时维持并保护这些单倍型的一致性。

cphasing utils fa2cluster haps.concat.fa -o haps.clusters.txt 

生成的 haps.clusters.txt 应包含两列内容：

1. group_id (单倍型组 ID)
2. contig_id (Contig ID)

示例（示意）：

h1   h1tg000001l
h1   h1tg000002l
h2   h2tg000001l
h2   h2tg000002l
h3   h3tg000001l
h4   h4tg000001l

提示：在单倍型感知模式（hapaware）下，-fc haps.clusters.txt 是引入单倍型先验信息的关键输入。

4. 运行 C-Phasing（Pore-C + hapaware）¶

结合原始的 Pore-C 数据并开启 --mode hapaware 运行主流程。这里我们挂载一个基本染色体数为 12 的四倍体（$2n = 4x = 48$，因此 -n 4:12）：

cphasing pipeline \
  -f haps.concat.fa \
  -pcd porec_reads.fastq.gz \
  --mode hapaware \
  -fc haps.clusters.txt \
  -o cphasing_hapaware_out \
  -t 32 -hcr -p AAGCTT -n 4:12